Techniques d'échantillonnage et d'analyse des moisissures de l'habitat > Consensus pour une plate-forme méthodologique

Après inventaire des nombreuses méthodes et techniques de prélèvement et d’analyse existantes, les membres du Groupe de travail (Conseil supérieur d'hygiène publique de France) ont estimé nécessaire d’établir des protocoles de travail recevant leur approbation.



Les indications fournies sont des conditions de bases minimales qui forment une plate forme méthodologique.

Selon la méthodologie d’investigation adoptée, des prélèvements de surface, d’air, de matériaux ou de poussières seront effectués. Ils permettront de récupérer la flore revivifiable dans les conditions de l’analyse et de l’identifier.

Chaque laboratoire peut évidemment ajouter telle ou telle technique en fonction des demandes qu’il aura à traiter et de ses possibilités techniques. En l’état actuel des connaissances, il parait prématuré de préconiser telle ou telle des techniques nouvelles issues de la biologie moléculaire ou de la (bio)chimie.

Dans tous les cas, les échantillons seront accompagnés d’une fiche permettant de les référencer et comportant un certain nombre d’indications indispensables à la future interprétation (localisation précise, moment de l’échantillonnage, conditions de prélèvement, nature du support échantillonné…).

Si ce ne sont pas les personnels du laboratoire qui pratiquent les échantillonnages, le laboratoire choisi pour les futures analyses et interprétations doit être consulté, avant leur mise en oeuvre sur site.

Les conditions d’échantillonnages d'air

1. Les prélèvements d’air seront effectués par impaction en milieu solide à l’aide d‘un appareil dont le laboratoire connaîtra les capacités et pour lequel il aura des références.
2. Deux essais au moins seront effectués l’un avec un milieu généraliste (milieu au malt complémenté par du chloramphénicol) et un autre milieu au choix du laboratoire concerné (malt + chloramphénicol, DG18, ES, ...). Le volume prélevé sera compris entre 80 et 100 litres pour l'air des locaux, la durée de prélèvement devant être au plus égale à 5 minutes.
3. Les fenêtres et portes de la pièce étudiée devront être fermées afin d’éliminer au mieux l’interférence de l’air extérieur, l’opérateur devra se placer dans les conditions habituelles d’occupation des locaux étudiés. Le capteur devra être à hauteur des voies respiratoires: cette condition pourra être remplie si l’échantillonneur est placé sur une table ou un pied de photographe.
4. Afin d’aider à l’interprétation future des résultats, il est nécessaire d’effectuer plusieurs échantillonnages dont une série de référence.

• Cas où des moisissures sont visibles : la pièce contaminée est la source de contamination et doit faire l’objet de prélèvements. La référence peut être l'air extérieur ou une pièce apparemment saine et éloignée de la précédente.
• Cas où il s'agit d'une pièce où une humidité anormale est constatée : La pièce humide est la source potentielle de contaminants et doit faire l’objet de prélèvements. La référence peut être l'air extérieur ou une pièce non humide.

Les conditions d'échantillonnage des surfaces

Chacune des techniques ayant leur propre intérêt, les échantillonnages seront effectués par deux techniques différentes au moins (par écouvillonnage, lame adhésive, ruban adhésif, boîte contact) en s’attachant à être représentatifs des différents aspects des zones contaminées ; des photographies des zones échantillonnées peuvent apporter une aide non négligeable.

1. Les écouvillons sont utilisés humides et transportés au laboratoire dans leur étui d'origine convenablement référencés et accompagnés de leur fiche d’échantillonnage.
2. Les lames et rubans adhésifs sont appliqués sur la surface sans appui excessif. Les boîtes «contact» peuvent être appliquées sur le support à l'aide d'un dispositif permettant des échantillonnages standardisés détachés de l’influence de l’opérateur.
3. Les milieux d'ensemencement seront les mêmes que ceux utilisés pour l'air.

Les conditions d'échantillonnage des poussières

1. La poussière est collectée à l’aide d’un aspirateur dédié et équipé spécialement. Il devra en particulier être équipé en sortie d’un filtre HEPA afin d'éviter toute dispersion de contaminants dans l'air des locaux.
2. Les prélèvements de poussières, doivent toujours être effectués après les prélèvements d’air car les manipulations de moquettes, tapis ou matelas peut apporter une contamination aéroportée parasite importante.
3. L’échantillon concernera une surface au minimum de 1 m² aspirée en 2 minutes.

Les conditions de transport et de stockage des échantillons

1. Les échantillons de milieu de culture (air, surfaces) convenablement référencés et accompagnés de leur fiche de route, doivent pourvoir être reçus par le laboratoire dans les 24 heures suivant le prélèvement afin que les modifications de la flore soient limitées au maximum.
2. Les écouvillons, lames adhésives et poussières, convenablement référencés et accompagnés de leur fiche de route, peuvent être envoyés sans tarder au laboratoire par la Poste ou autre transporteur.
3. Les produits liquides, convenablement référencés et accompagnés de leur fiche de route, sont envoyés dans des conteneurs choisis en accord avec les dispositions sur l’envoi de produits biologiques.

Le laboratoire d’analyse sera seul juge des conditions de transfert des échantillons jusqu’à son site, en fonction des circonstances.

Les conditions des primocultures

1. Les prélèvements d'air se faisant directement sur un milieu de culture, il s'agit des primo cultures sans préjuger des conditions des subcultures d'isolement ou d'identification ultérieures. Il en sera de même pour les lames adhésives ou les boîtes contact.
2. Si un seul milieu est utilisé, les écouvillons sont ensemencés par épuisement, directement sur le milieu choisi mais on peut choisir de le plonger dans 2 mL de milieu liquide type Sabouraud plus tween et d'homogénéiser à l'aide d'un agitateur type « vortex ». Des aliquotes (0,1 mL) seront ensuite ensemencées à la surface de milieux de primo culture.
3. Les primo cultures sont incubées à 25°C ±1°C pour la flore habituelle et entre 37 et 44 °C pour la flore thermophile à l'origine de certaines pathologies.
   Dans le premier cas, les lectures se feront après 7 jours d'incubation. Une lecture intermédiaire permettra de détecter les boîtes envahies par des souches à croissance rapide qui seront éliminées après examen.
   Dans le deuxième cas, les lectures se font après 2 jours d'incubation ; l'incubation sera prolongée jusqu'à 7 jours si la culture est négative à ce premier stade.

Les résultats

1. Les résultats seront exprimés en nombre de colonies apparues dans les conditions cidessus par volume d'air prélevé ou par surface prélevée. La plupart des impacteurs possédant une table statistique de correction, les nombres fournis seront les nombres corrigés. Si l'analyste le juge utile, il pourra également fournir un résultat rapporté au mètre-cube d'air ou au décimètre-carré pour les surfaces, au gramme pour la poussière. L'analyste fera une distinction entre un dénombrement impossible par suite d'une trop grande richesse en colonies et celui rendu impossible par l'occupation de toute la surface de culture par une souche à croissance rapide.
2. Les colonies seront identifiées selon les techniques habituelles en mycologie. Le niveau de l'espèce devra le plus souvent possible être atteint et en particulier pour les moisissures.
   Les différents genres et espèces identifiées seront fournis par ordre décroissant en nombre ou sous forme de pourcentage de la flore totale identifiée.
3. Le rapport d’analyses doit indiquer les conditions
   • d’échantillonnage (type d’échantillonneur et sa version, volume/surface échantillonné) ;
   • d’environnement (thermohygrométrie, ventilation…) ;
   • les références des échantillons (n°, date, heure, localisation) et toutes indications nécessaires à sa bonne compréhension.
   L'analyste donnera des commentaires sur les résultats en s'appuyant sur ses propres bases de données qui serviront de référence ou sur des bases de données existantes si les conditions d'analyse sont les mêmes et dont il citera l'origine. Il s’appuiera également sur les fiches d’enquête sur site et de route.