Techniques analytiques d'échantillonnage et d'analyse des moisissures de l'habitat > Mesure des composants provenant des champignons

La plus grande stabilité dans le temps des composants provenant des cellules fongiques et leur indépendance vis-à-vis de la viabilité des moisissures sont les principaux avantages de ces méthodes.



Glucanes

Constituants des spores fongiques, présents dans la plupart des espèces, les (1 - 3)-ß-D-glucanes sont dosés par la méthode Limulus Amoebocyte Lysate modifié ou LAL (également utilisé pour les dosages d’endotoxines bactériennes) ou par un test immunochimique (Enzyme immuno-assay: EIA) qui n’est pas commercialisé.

La méthode par LAL est assez simple (disponible sur le marché) et sensible, mais peu spécifique, les glucans étant également présents dans les végétaux. La méthode par EIA est plus reproductible et plus spécifique mais n'est pas assez sensible pour les recherches dans l'air.

Les dosages ne donnent pas d'information sur les espèces et il n'y a pas de données de référence pour l'interprétation des résultats ainsi obtenus. Dans leur étude, Chew et coll ont montré une association entre la quantité de glucans spécifiques de Penicillium et d’Aspergillus et les concentrations de spores fongiques dans des poussières de maisons.

Dosage de la chitine

Poly-ß-1,4-N-acétyl glucosamine, la chitine est présente dans la paroi des micromycètes et est absente du matériel végétal. Le principe du dosage de cette molécule, mis au point par Donald et Mirocha, en 1977 pour évaluer l’importance de la contamination fongique des grains, repose sur l’hydrolyse de la chitine en glucosamine, dosée par colorimétrie ou chromatographie. Les résultats obtenus en 5-6 heures rendent compte de la chitine du mycélium vivant et mort, mais peuvent être biaisés dans la mesure où les moisissures ont des teneurs en chitine variables (de 1 à 25% du poids sec du mycélium) selon les espèces, l’âge du mycélium et la nature du substrat. La présence de certaines substances du substrat, telles que des hexosamines, peuvent également fausser le résultat.

Antigènes - Allergènes

Les antigènes sont des molécules qui peuvent induire une réponse immunologique (production d'immunoglobulines sériques) chez les mammifères. Les allergènes sont des antigènes qui peuvent causer une réaction allergique, en se liant à un anticorps spécifique. Les méthodes immunochimiques permettent de détecter des antigènes au moyen d'anticorps spécifiques de ces antigènes. Un marquage préalable des anticorps d’origine animale ou humaine (isotopique, enzymatique, fluorescent ou luminescent) permet de détecter et de quantifier la présence de complexes antigène - anticorps. La technique ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) combine un marquage enzymatique et l'utilisation de substrats chromogéniques.

Pour l'instant peu d'études ont retrouvé des antigènes d'origine fongique dans l'air , pour les raisons suivantes : peu d'antigènes fongiques ont pour l'instant été identifiés, certains antigènes fongiques ne sont pas présents sur les spores mais apparaissent seulement après germination, enfin l'expression des antigènes peut varier, en fonction des conditions de croissance. Une avancée importante concerne le genre Alternaria : grâce à la production d'un antigène recombinant d'Alternaria alternata, des extraits antigéniques standardisés pourront être utilisés comme réactifs de diagnostic. Le même développement est en cours pour Aspergillus fumigatus ainsi que pour Cladosporium, Alternaria ou Stachybotrys chartarum. Des tests concernant la détection d’Aspergillus niger et Stachybotrys chartarum sont en cours de commercialisation.

En revanche ce type d'analyse ne permet de rechercher qu'une seule espèce à la fois alors que la liste des agents susceptibles d'avoir des effets sur la santé est longue. De plus il existe des réactions croisées entre espèces. Enfin, la sensibilité de cette technique est faible.

Polysaccharides extracellulaires (EPS)

Polymères hydrocarbonés excrétés par la plupart des moisissures, immunogènes chez l'homme et l'animal, les EPS peuvent être détectées par méthodes immunochimiques (ELISA). Les anticorps produits (IgG) reconnaissent des structures spécifiques du genre mais pas des espèces (Ex : Cladosporium, Alternaria, Aspergillus, Penicillium, Mucor…).

Cette méthode est rapide, simple, spécifique de larges groupes de micro-organismes. En revanche il n’existe pas, à ce jour, de valeurs de référence pour l'interprétation des résultats. Par ailleurs des réactions croisées existent entre les genres Aspergillus et Penicillium. Enfin ce test n’est pas encore disponible sur le marché et n’a pas été évalué.

Composés organiques volatils d'origine microbiologique (COVm)

Les COVm sont utilisés pour détecter des problèmes d'humidité et de biocontamination non apparents dans des immeubles où des plaintes concernant les odeurs ont été formulées. Ces composés sont prélevés sur des tubes adsorbants (de type Tenax ou charbon activé) par des techniques de prélèvement actif ou passif. Après extraction par solvant ou désorption thermique, les COVm sont classiquement déterminés par chromatographie gazeuse avec détection par spectrométrie de masse ou ionisation de flamme.

Cette méthode détecte une contamination fongique même en l'absence de moisissure apparente, les COVm pouvant diffuser à travers les matériaux (revêtements muraux, planchers…). En revanche, elle manque de spécificité : non seulement elle ne permet pas d'identification d'espèce, mais les COVm produits dépendent aussi du substrat (matériaux de construction, peintures, adhésifs, gaz d'échappement…), de la souche et de l'age de la culture.

Ergostérol

Le dosage de l'ergostérol (stérol principal constitutif des champignons) peut représenter une évaluation de la charge fongique totale. Après recueil sur filtre ou grâce à un appareil de collecte à coupelle rotative, l'ergostérol est dosé par chromatographie en phase liquide (HPLC) ou chromatographie gazeuse et spectrométrie de masse. La concentration d'ergostérol dans l'air peut être mesurée sur plusieurs jours. Elle représenterait une bonne évaluation de la biomasse fongique. En utilisant conjointement le dosage en HPLC et un appareil de collecte à coupelle rotative, la mesure de cette biomasse fongique globale est rendue possible avec une limite de quantification de 0,4 ng/m3 soit une valeur théorique de 150 spores par m³.

La méthode est spécifique, rapide et permet l'analyse de plusieurs échantillons à la fois. La méthode ne permet pas d'identification, et peut sous-évaluer les levures. Les travaux de Douwes ont montré une association entre les niveaux d'ergostérol et d'autres constituants (glucans, EPS) et les champignons viables dans les poussières.

Mycotoxines

Les mycotoxines sont des toxines capables de diffuser en dehors du champignon. On peut les retrouver dans les spores, le mycélium et le support de croissance des champignons ou adsorbées sur les poussières. On en dénombre plus de 300, émises par de nombreuses espèces fongiques. La biosynthèse de ces molécules dépend de plusieurs facteurs dont la souche productrice, les éléments nutritifs disponibles (composition du substrat) et certains facteurs externes comme l’activité de l’eau (Aw), la valeur du pH, la température, la quantité d’oxygène et de dioxyde de carbone contenu dans l’air, l’intensité lumineuse et la présence d’autres microorganismes en compétition. Toutes les souches d’une même espèce ne sont pas systématiquement productrices de mycotoxines, comme l'ont constaté Tuomi et coll lors d'une étude réalisée dans 79 habitations contaminées par des moisissures.

Les mycotoxines étant non volatiles, l'exposition par inhalation est essentiellement liée à l'inhalation des spores ou des poussières sur lesquelles elles se sont adsorbées.

Les principales mycotoxines connues sont :

• les aflatoxines produites principalement par Aspergillus flavus.
• les tricothécènes qui regroupent plusieurs dizaines de mycotoxines différentes produites par de nombreuses espèces dont Fusarium sp. et Stachybotrys chartarum.
• les ochratoxines produites principalement par Aspergillus ochraceus et 12 espèces de Penicillium.
• Stérigmatocystine produite essentiellement par Aspergillus versicolor.

Le dosage des mycotoxines dans l’air est encore très peu répandu. Certains trichothécènes sont également dosés par HPLC ou Chromatographie gazeuse et spectrométrie de masse. Ces méthodes sont complexes et nécessitent des équipements spéciaux. Des travaux sont en cours pour développer de nouvelles méthodes de détection rapide des trichotécènes (méthodes immunochimiques, PCR) dans les poussières ou l'air.

Techniques moléculaires

Les techniques moléculaires (hybridation, profil de restriction, caryotypage, empreintes ADN) ont été largement utilisées en microbiologie clinique, notamment pour l’identification fongique. Ces méthodes sont souvent fastidieuses et nécessitent de disposer d’une grande quantité d’ADN. Les méthodes basées sur les techniques d’amplification génique telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction), sont des méthodes rapides et plus sensibles. Le plus récent développement de ce type de méthode, la PCR en temps réel, représente une avancée technique majeure dans le domaine de la détection et de l’identification des micro-organismes. C’est une méthode reproductible et sensible, qui permet d’obtenir des seuils de détection très bas (de l’ordre du fg d’ADN/µL). Elle permet également une standardisation et une automatisation des analyses, et peut de ce fait être utilisée en routine. Elle se développe actuellement dans de nombreux domaines de la microbiologie, mais aussi en mycologie clinique (détection d’Aspergillus fumigatus dans les liquides biologiques et en mycologie environnementale (détection de Stachybotrys dans l’air. L'application de ces techniques aux prélèvements atmosphériques permettrait d'éliminer les difficultés et incertitudes liées à la culture, et de distinguer des souches productrices de toxines. Toutefois, cette méthode ne permet pas de différencier les cellules viables des non viables (quantification de l’ADN total présent dans l’échantillon). Elle nécessite l’utilisation de sondes spécifiques qui doivent être conçues pour chaque espèce, ce qui impose de développer un test par espèce. Cependant, le coût hors équipement est modéré. La difficulté essentielle réside dans le choix des séquences pour la conception des sondes car le séquençage des espèces fongiques n’est pas encore généralisé, et pour un certain nombre d’espèces environnementales, aucune séquence n’est actuellement disponible dans les banques génomiques.