Techniques analytiques d'échantillonnage et d'analyse des moisissures de l'habitat > Les cultures

Les mesures de micro-organismes viables sont pratiquées depuis plusieurs décennies, les consensus sont récents en Europe comme aux Etats-Unis et des travaux se poursuivent pour optimiser la reproductibilité et la représentativité des résultats. Ces méthodes restent indispensables malgré leur lourdeur et leurs insuffisances, car elles sont pour l'instant les seules qui permettent une identification des micro-organismes.

Cependant, il est clairement établi que la fraction cultivable des micro-organismes de l'air ne représente qu'une partie de leur pathogénicité et une faible partie de leur nombre (0,1 à 10% selon les auteurs). Il existe plusieurs milieux de culture pour une même famille de champignons. Certains genres ont des besoins nutritifs spécifiques (cellulotiques, osmophiles) ou des conditions d’incubations spécifiques (thermophiles, psychrophiles). Les milieux les plus utilisés sont :



• Milieu à l'extrait de malt (Malt Extract Agar ou MEA), considéré comme le plus adapté aux moisissures de l'environnement. Il a pour inconvénient de faciliter l'envahissement par des souches à croissance rapide (Rhizopus, Mucor), risquant de masquer les autres colonies et de sous-évaluer le nombre de colonies réel.
• Milieu Rose Bengale : ce milieu inhibe la croissance de ces espèces à croissance rapide et les colonies restent plus petites donc plus facilement dénombrables. Cependant il se décompose à la lumière et peut devenir toxique pour certaines espèces fongiques. De plus, la pigmentation des colonies peut compliquer l’identification.
• Milieu DG18 (dichloran glycerol 18) : ce milieu est adapté aux champignons xérophiles, est de plus en plus utilisé et donnerait des résultats comparables ou supérieurs au MEA (inhibition partielle des espèces à croissance rapide et dénombrement et identification plus faciles).
• Milieu Sabouraud : classiquement utilisé pour la recherche de champignons en clinique, ce milieu reste parfois utilisé dans certaines études environnementales, mais n’est pas satisfaisant. La croissance exubérante de certaines espèces rend les dénombrements difficiles.

Des antibiotiques (chloramphénicol et / ou gentamycine) destinés à inhiber la croissance bactérienne sont ajoutés à tous ces milieux.

Les températures d'incubation très variables selon les équipes par le passé, sont maintenant plus homogènes, entre 25 et 30°C pour les flores fongiques globales, 35-42°C pour les espèces thermotolérantes d’Aspergillus.

La durée d'incubation est comprise entre 7 et 14 jours avec une lecture à 3 jours puis une surveillance régulière de la croissance pour éviter l'envahissement des boîtes par certaines espèces.

Le dénombrement et l'identification des champignons repose sur un examen macroscopique et microscopique des colonies par des mycologues entraînés. L'examen macroscopique des colonies et l’observation microscopique de la morphologie des spores et du mycélium permettent d’identifier les moisissures collectées. Si l’identification du genre ne pose en général pas de problème à un mycologue, l’identification de l’espèce est plus délicate. Ainsi, certaines espèces aussi communes que les Penicillium restent d’identification difficile et nécessitent une batterie de milieux et une grande expertise. Le recours au séquençage de l’ADN, lorsque la séquence a déjà été décrite, peut s’avérer une aide précieuse.